원심분리의 기초

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이 튜토리얼의 목적은 어휘, 원심분리기 및 로터 유형, 분리 기술, 심지어 기울기 선택을 포함한 원심 분리의 기본 개념을 소개하는 것입니다. 원심분리에 대한 자세한 내용은 참조 섹션에 인용된 Sorvall®와 Heraeus 문헌을 읽을 것을 권장합니다.

내용

I. 소개
II. 중력 효과 증가: 원심분리기
III. 원심분리의 종류
IV. 로터 분류
V. 원심분리관 선택
VI. 일반적인 원심분리기 용어 및 공식
VII. 참조 및 권장 문헌

 

I. 소개

원심분리는 생화학, 세포생물학, 분자생물학, 의학에서 가장 중요하고 광범위하게 적용되는 연구 기술 중 하나입니다. 현재의 연구 응용은 종종 높은 수율의 세포, 아세포 오르간 및 고분자의 분리에 의존합니다.

원심분리기는 원심력(g-force)을 사용하여 부유 입자를 주변 매질로부터 일괄적으로 또는 연속적으로 분리합니다. 원심분리는 세포와 바이러스의 침전, 세포하 기관의 분리, DNA, RNA, 단백질 또는 지질과 같은 고분자의 분리를 포함할 수 있습니다.

II. 중력 효과 증가: 원심분리기

주어진 시간에 액체 현탁액의 많은 입자나 셀은 결국 중력(1 x g)으로 인해 용기 바닥에 가라앉습니다. 그러나 그러한 분리에 필요한 시간의 길이는 실용적이지 않습니다. 매우 작은 크기의 다른 입자들은 높은 원심력을 받지 않는 한 용액에서 전혀 분리되지 않습니다. 서스펜션이 특정 속도 또는 분당 회전수(RPM)로 회전하면 원심력에 의해 입자가 회전축에서 반경 방향으로 멀어지게 됩니다. 입자에 가해지는 힘(중력 대비)을 상대 원심력(RCF)이라고 합니다. 예를 들어, 500 x g의 RCF는 적용되는 원심력이 지구의 중력보다 500배 더 크다는 것을 나타냅니다. 표 1은 일반적인 원심분리기 등급과 그 적용을 보여줍니다.

Table 1. Classes of centrifuges and their applications.

  Centrifuge Classes
Lowspeed High-speed Ultra/micro-ultra
Maximum Speed (rpm x 103) 10 28 100/150
Maximum RCF (x103) 7 100 800/900
Pelleting applications
Bacteria Yes Yes (Yes)
Animal and plant cells Yes Yes (Yes)
Nuclei Yes Yes (Yes)
Precipitates Some Most (Yes)
Membrane fractions Some Some Yes
Ribosomes/Polysomes - - Yes
Macromolecules - - Yes
Viruses - Most Yes

( ) = can be done but not usually used for this purpose

III. 원심분리의 종류

1. 차동 원심 분리(Differential centrifugation). 분리는 주로 미분 원심분리에서 입자의 크기에 기초하여 달성됩니다. 이러한 유형의 분리는 일반적으로 단순한 펠렛 작업에 사용되며 부분적으로 순수한 세포소기관 및 고분자를 준비하는 데 사용됩니다. 세포 소기관 연구를 위해, 조직이나 세포는 내부 내용물을 방출하기 위해 먼저 파괴됩니다. 이러한 조잡한 파괴된 세포 혼합물을 호모제네이트(균질 현탁액)라고 합니다. 세포 균질체의 원심분리 과정에서 큰 입자는 작은 입자보다 더 빠르게 침전되며, 이는 미분 원심분리를 통해 천연의 핵 분획을 얻을 수 있는 기초를 제공합니다. 세포 균질산은 부분적으로 정제된 세포 소기관의 펠릿을 생성하기 위해 일련의 점진적으로 높은 g-힘과 시간에서 원심 분리될 수 있습니다.

균질한 세포를 1000 x g에서 10분간 원심분리하면 부서지지 않은 세포와 무거운 핵이 튜브 바닥에 펠릿을 형성합니다. 상등액은 10,000 x g에서 20분 동안 원심분리되어 미토콘드리아, 리소좀, 미생물과 같은 중간 속도의 세포하기관을 펠릿화할 수 있습니다. 이러한 침전 세포 소기관의 일부는 부분 순도로 얻을 수 있으며, 일반적으로 다른 입자에 오염됩니다. 아이소토닉 용제에 다시 매달아 펠릿을 반복적으로 세척하면 크기가 더 작은 오염물이 제거될 수 있습니다(그림 1). 미분 원심 분리에 의해 부분적으로 정제된 세포를 얻는 것은 다른 유형의 원심 분리(밀도 구배 분리)를 사용하여 추가적인 정제를 위한 예비 단계로 작용합니다.

2. 밀도 구배 원심 분리 (Density gradient centrifugation). 밀도 구배 원심분리는 세포 소기관 및 고분자를 정제하기 위해 선호되는 방법입다. 밀도 구배는 바닥에 가장 무거운 층이 있고 상단에 가장 가벼운 층이 있는 튜브에 수크로스와 같은 구배 매체(표 2)의 층을 불연속 또는 연속 모드로 배치하여 생성할 수 있습니다. 분리될 셀 분율은 층 위에 배치되어 원심 분리됩니다. 밀도 구배 분리는 두 가지 범주로 분류할 수 있습니다. 2a. 속도-구역(크기) 분리. 2b. Isopycnic(밀도) 분리.

2a. Rate zonal (size) separation

속도-구역 분리는 침전을 위한 입자 밀도 대신 입자 크기와 질량을 이용합니다. Figure 2는 속도 구역 분리 프로세스와 성공적인 속도 구역 분리 기준을 보여줍니다. 일반적인 적용의 예로는 엔도솜과 같은 세포 기관의 분리 또는 항체와 같은 단백질의 분리가 있습니다. 예를 들어, 항체 등급은 모두 매우 유사한 밀도를 가지고 있지만, 질량은 다릅니다. 따라서 질량에 기초한 분리는 다른 클래스를 분리하는 반면, 밀도에 기초한 분리는 이러한 항체 클래스를 해결할 수 없습니다.

특정 유형의 로터는 다른 로터보다 이러한 유형의 분리에 더 적합합니다. 로터 범주(아래)와 Table 2를 참조하십시오.

성공적인 레이트 존 원심분리 기준:

  • 시료 용액의 밀도는 구배의 가장 낮은 밀도 부분의 밀도보다 작아야 합니다.
  • 시료 입자의 밀도는 구배의 가장 높은 밀도 부분의 밀도보다 커야 합니다.
  • 그라데이션의 경로 길이는 분리가 발생하기에 충분해야 합니다.
  • 시간은 중요합니다. 너무 긴 작동을 수행할 경우 튜브 바닥에 입자가 펠릿을 형성할 수 있습니다.

2b. Isopycnic separation

이러한 분리 유형에서, 특정 밀도의 입자는 주변 용액의 밀도가 입자의 밀도와 정확히 같은 위치에 도달할 때까지 원심 분리 중에 가라앉게 됩니다. 일단 이 준평형에 도달하면, 원심 분리의 길이는 입자의 이동에 아무런 영향을 미치지 않습니다. 이 방법의 일반적인 예는 CsCl 구배에서 핵산의 분리입니다. Figure 3은 아이소픽 분리와 성공적인 분리 기준을 보여줍니다. 다양한 구배 매체가 이소프닉 분리에 사용될 수 있으며 생물학적 용도는 Table 2에 나열되어 있습니다.

성공적인 밀도 분리 기준:

  • 샘플 입자의 밀도는 구배 밀도의 한계 내에 있어야 합니다.
  • 모든 그라데이션 길이를 사용할 수 있습니다.
  • 실행 시간은 입자가 등각점에서 밴드를 형성하기에 충분해야 합니다. 과도한 실행 시간은 악영향을 미치지 않습니다.

Table 2. Applications of density gradient media for isopycnic separations.

Gradient media Cells Viruses Organelles Nucleoproteins Macro-molecules
Sugars
(e.g. sucrose)
+ +++ +++ + -
Polysaccharides
(e.g. Ficoll)
++ ++ ++ - -
Colloidal silica
(e.g. Percoll)
+++ + +++ - -
Iodinated media
(e.g. Nycodenz)
++++ ++ ++++ +++ +
Alkali metal salts
(e.g. CsCl)
- ++ - ++ ++++

++++ excellent, +++ good, ++ good for some applications, + limited use, - unsatisfactory

Source: D. Rickwood, T.C. Ford, J. Steensgard (1994) Centrifugation essential data, John Wiley & Sons Ltd. U.K.

IV. 로터 분류

로터는 크게 스윙 버킷 로터, 고정 각도 로터 및 수직 로터의 세 가지 공통 범주로 분류할 수 있습니다(그림 4, 표 3). 각 로터 유형은 분리 유형에 따라 강도와 한계가 있습니다.

  1. 스윙 버킷
  2. 고정 각도
  3. 수직

다른 로터는 연속 흐름 및 용출 로터를 포함합니다.

Table 3. Types of rotors and their applications.

Type of rotor Pelleting Rate-zonal Sedimentation Isopycnic
Fixed-angle Excellent Limited Variable*
Swinging-Bucket Inefficient Good Good**
Vertical NS Good Excellent
Zonal NS Excellent Good

NS = not suitable
*Good for macromolecules, poor for cells, and organelles
**Good for cells and organelles, caution needed if used with CsCl

스윙 버킷 로터의 경우 샘플 튜브가 로터가 정지해 있는 동안 수직으로 매달리는 개별 버킷에 로드됩니다. 로터가 회전하기 시작하면 버킷이 수평 위치로 회전합니다(그림 4). 이 로터는 샘플이 밀도 구배로 분해될 때 특히 유용합니다. 경로 길이가 길수록 혼합물에서 개별 입자 유형을 더 잘 분리할 수 있습니다. 그러나, 이 로터는 펠렛팅에 상대적으로 비효율적입니다. 또한, CsCl 또는 침전될 수 있는 다른 밀도 높은 경사 물질의 회전으로 인한 "점 부하"를 방지하기 위해 주의해야 합니다.

고정 각도 로터에서 샘플 튜브는 로터 캐비티의 각도에 고정되어 있습니다. 로터가 회전하기 시작하면 튜브의 용액이 방향을 바꾸게 됩니다(그림 4). 이 로터 유형은 펠릿 애플리케이션에 가장 일반적으로 사용됩니다. 예를 들어, 껍질을 벗기는 박테리아, 효모, 그리고 다른 포유류의 세포들이 있다. 또한 핵산과 같은 고분자의 이소피닉 분리에도 유용합니다.

수직 로터에서 샘플 튜브는 회전 중에 수직 위치로 고정됩니다. 이 유형의 로터는 펠릿 애플리케이션에는 적합하지 않지만 짧은 경로 길이로 인해 아이소픽(밀도) 분리에 가장 효율적입니다. 애플리케이션은 plasmid DNA, RNA, 리포단백질 분리를 포함한다.

V. 원심분리관 선택

Table 4와 5는 원심분리관 특성과 이를 사용해야 하는 적절한 로터를 보여줍니다.

올바른 원심분리관 선택:

튜브(플라스틱) 재료 선택의 주요 요인:

  • 검체 누출 또는 손실 방지
  • 화학적 호환성 보장
  • 쉬운 샘플 복구
  • 명료함
  • 내화학성
  • 밀봉 메카니즘 (필요 시)

    Table 4- Chemical Compatibility of Popular Tube Materials

    Tube Plastic Type Clarity Chemical Resistance*
    Polypropylene (PP) Opaque Good
    Polyallomer (PA) Opaque Good
    Polycarbonate (PC) Clear Poor
    Polyethylene terephtalate (PET) Clear Poor

    * 자세한 내용은 이 웹사이트에서 구할 수 있는 내화학성 차트를 참조하십시오.

  • 권장 샘플 용량 및 최대 속도에 대한 참고 사항은 제품 가이드 페이지 또는 튜브 포장을 확인하십시오.
  • 항상 얇은 두께의 밀봉된 튜브를 고정된 각도 또는 수직 로터로 가득 채웁니다.
    예시:
    - 다중 씰링 어셈블리가 있는 개방형 상단 튜브
    - 재밀봉된 튜브
    - Ultracrimp® & Clearcrimp® tubes
  • 절대적으로 필요한 경우에만 고압 멸균 튜브를 사용하고 121°C에서 15분 동안만 사용해야 합니다.
  • 자동 식기 세척기나 유리 식기 세척기에서 플라스틱 튜브를 청소하는 것은 피하십시오.
  • 튜브는 따뜻한 물에 순한 실험실 세제로 세척하고 헹군 후 공기를 건조시키는 것이 좋습니다.
  • 튜브는 아래 표 5에 나와 있는 것처럼 샘플 손실 및/또는 고장을 방지하기 위해 로터 유형과 신중하게 일치시켜야 합니다.

튜브 수명을 연장하고 파손 또는 붕괴를 방지하려면:

Table 5 - Tube Type and Rotor Compatibility

  Rotor Type
Tube type Fixed-angle Swinging-bucket Vertical
Thin wall open top No Yes No
Thick wall open top Yes Yes No
Thin wall sealed Yes Some tube types Yes
Oak ridge Yes No No

VI. 일반적인 원심분리기 용어 및 공식

  • Pellet: hard-packed concentration of particles in a tube or rotor after centrifugation.
  • Supernatant: The clarified liquid above the pellet.
  • Adapter: A device used to fit smaller tubes or centrifugal devices in the rotor cavities.
  • RPM: Revolutions Per Minute (Speed).
  • Rmax: Maximum radius from the axis of rotation in centimeters.
  • Rmin: Minimum radius from the axis of rotation in centimeters.
  • RCF: Relative centrifugal Force. RCF = 11.17 x Rmax (RPM/1000)2
  • K-factor: Pelleting efficiency of a rotor. Smaller the K-factor, better the pelleting efficiency.
  • S-value: the sedimentation coefficient is a number that gives information about the molecular weight and shape of the particle. S-value is expressed in Svedberg units. The larger the S-value, the faster the particle separates.

    For more information about sedimentation coefficients, please refer to the section on references and suggested readings in this article.

  • Pelleting time: time taken to pellet a given particle. T = K/S where T= pellet time in hours. K = K-factor of the rotor, and S = sedimentation coefficient.
  • Rotor conversion formula: If the time to pellet a sample in your “old” rotor is known, one could determine the time it would take for the same sample to pellet in a “new” rotor. The formula for this determination is as follows:
  • Where:
    T1 = Time to pellet in the “new” rotor
    T2 = Time to pellet in the “old” rotor
    K1 = K-factor of the “new” rotor
    K2 = K-factor of the “old” rotor

     

    Example of a rotor conversion:

    Old Rotor (Beckman® JA-10) New Rotor (Sorvall® SLC-1500)

    T2 = 20 min; K2 = 3610 T1 = ( ? ) min; K1 = 1676

    Old Pelleting Time = 20 min New Pelleting Time = 9.2 min

VII. 참조 및 권장 문헌

  1. Biological Centrifugation, by D. Rickwood, J.M. Graham (2001). Springer Verlag; ISBN: 0387915761
  2. Subcellular Fractionation: A Practical Approach, by John M. Graham (Editor) and D. Rickwood (Editor) (1997). Oxford Univ Press. ISBN: 0199634947
  3. Centrifugation: Essential Data, by David Rickwood, T. Ford, Jens Steensgaard (1994). 128 pages. John Wiley & Son Ltd. ISBN: 0471942715
  4. Centrifugation : A Practical Approach, by David Rickwood, (Editor) (1992) ASIN: 090414755X.
  5. An Introduction to Centrifugation, by TC. Ford and J.M. Graham (1991). 118 pages. BIOS Scientific Publishers, Ltd. ISBN 1 872748 40 6

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