단백체학

단백체학 워크플로우

Avantor는 여러분의 니즈에 맞는 포괄적인 장비, 제품 및 소모품을 보유하고 있습니다.

	단백질 발현 및 정제
	cGMP 등급 IPTG 단백질 A 크로마토그래피 수지 단백질 정제 시약 및 키트 샘플 파괴 및 균질화 관련 제품

	단백질 전기영동 및 블로팅
	아크릴아마이드 블로팅 도구 블로팅 종이 분자량 표시 마커 전원 공급 장치 수직 겔 전기영동 시스템

	단백질 검출 및 분석
	HPLC & UHPLC용 컬럼 필름 및 강화 스크린 HTS 마이크로플레이트 면역학 마이크로플레이트 및 스트립

 

단백질 정제란 무엇인가요?

• 개요: 단백질은 세포 구조와 기능에 필수적인 역할을 합니다. 이러한 단백질을 정제하는 이유는 복잡한 혼합물에서 원하는 단백질을 얻고 연구하기 위해 수행되고 있습니다. 단백질을 분리하면 아래에 나열된 단백질의 특징들을 분석하는 데 도움이 됩니다.
  • 크기와 구조
  • 결합 친화력
  • 생물학적 활성
  • 물리학적 특성
  • 단백질 간의 상호작용

 

단백질 정제 내 다운스트림 처리 공정

바이오 치료제 제조의 마지막 단계는 단백질 정제 내 다운스트림 처리로, 이는 표적 단백질을 수확하고 정제하는 단계입니다.

다운스트림 처리는 세포, 조직 배양액 또는 식물 조직과 같은 생물학적 물질을 채취하여 순수하고 균질한 단백질을 추출하는 데 필요합니다.

물질이 방대하고 다양한 비표적 분자가 있는 생물학적 매트릭스에 갇혀 있기 때문에 다운스트림 처리는 오염 물질과 구별되는 물리적 및 화학적 특성을 활용하여 표적의 순도를 점진적으로 높이는 다단계 과정입니다.

다운스트림 처리에는 미립자, 탄수화물, 오일과 같은 대량의 오염 물질을 제거하는 포집 및 정화 단계와 공급 스트림을 정제하는 포집 및 연마 단계를 거쳐 표적 제품만 남을 때까지 정제하는 단계가 포함됩니다.

귀사의 바이오의약품 단클론 항체(mAb) 생산 공정에서 다운스트림 처리 시간을 단축할 수 있도록 도와드리기 위해 Avantor의 전문가가 상시 대기 중입니다. 간단한 문의 양식을 작성해주시면 귀사의 단백질 정제 공정에 도움을 드리겠습니다.

 

4가지 단백질 정제 기법

단백질 정제는 일련의 과정들을 통해 단백질의 순도를 높이는 작업입니다.

단백질을 정제하려면 시작 물질로 시작하여 수많은 물리적 또는 생화학적 접근법 중 하나를 사용하여 단백질을 분획해야 합니다. 초기 물질은 아래에 설명된 것과 같이 허용되는 접근법을 사용하여 분획으로 분리할 수 있습니다.

기존 물질에서 추출한 후 원심분리를 수행하여 단백질을 분리합니다. 마지막으로 크로마토그래피와 같은 미세 분해 기술을 통해 최종 물질을 얻습니다.

기법 # 1. 추출:
공급원에 따라 단백질이 포함된 조직이나 세포를 부수어 용액으로 가져와야 합니다. 이를 달성하기 위한 몇 가지 단백질 정제 기법이 있습니다:

• 냉동과 해동 반복
• 초음파 처리
• 고압에 의한 균질화
• 유기 용매에 의한 투과화

단백질이 얼마나 취약한지, 세포가 얼마나 튼튼한지에 따라 기법을 달리할 수 있습니다.

기법 # 2. 침전 및 차등 가용화:
대량 단백질 정제에서 단백질을 분리하기 위한 일반적인 첫 번째 단계는 황산암모늄으로 침전시키는 것입니다. 이는 점점 더 많은 양의 황산암모늄을 첨가하고 침전 단백질의 다른 분획을 수집하여 수행됩니다.

이 기법의 장점은 매우 많은 양으로 저렴하게 수행 할 수 있습니다.

기법 # 3. 원심분리:
원심분리는 원심력을 사용하여 액체에 현탁된 다양한 질량 또는 밀도의 입자 혼합물을 분리하는 과정입니다. 단백질 또는 박테리아 세포와 같은 기타 입자상 물질이 혼합된 용기(일반적으로 튜브 또는 병)를 고속으로 회전시키면 각 운동량이 각 입자에 질량에 비례하는 외력을 생성합니다.

시료를 "회전"시키는 순 효과는 거대하고 작고 밀도가 높은 입자가 덜 거대하거나 액체에서 "항력"이 더 많은 입자보다 바깥쪽으로 더 빨리 이동합니다.

기법 # 4. 크로마토그래피 기법:
일반적으로 단백질 정제 프로토콜에는 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 포함됩니다. 크로마토그래피의 기본 절차는 단백질이 포함된 용액을 다양한 물질로 포장된 컬럼을 통해 흘려보내는 것입니다. 단백질마다 컬럼 재료와 상호 작용하는 방식이 다르므로 컬럼을 통과하는 데 필요한 시간에 따라 분리할 수 있습니다.

단백질 정제에서의 단백질 추출

단백질 추출 과정은 여과, 원심분리, 가용화 및 침전을 거친시료를 사용하여 친밀도 컬럼 및 면역 침전 등의 기법으로 정제합니다. 다음은 일반적인 워크플로우입니다:

• 초음파 처리를 통해 세포를 용해 또는 동결하거나 분쇄 혹은 균질화를 통해 조직을 균질화합니다. 이 과정을 통해 세포벽이 파괴되고 단백질이 시료로 방출됩니다. 그런 다음 조직 샘플을 필터링하여 큰 이물질을 제거할 수 있습니다.
• 세포 파편을 제거하기 위해 샘플을 원심분리합니다. 이 과정은 일반적으로 원심분리기에서 차등 원심분리 또는 밀도 구배 원심분리를 통해 수행됩니다. 이 단계는 엑소좀 단백질과 같은 특정 구획 단백질을 추출하는 데 특히 유용할 수 있습니다.
• 적절한 단백질 추출 버퍼에 샘플을 다시 현탁합니다. 이 완충액에는 적절한 양의 염이 포함되어 있고, pH 6-8을 유지하기 위한 완충제가 포함되어 있으며, 필요한 세제, 환원제, 변성제 또는 프로테아제 억제제가 포함되어 있습니다.
• 생체 자기 분리는 표적 단백질 용액의 추가 정제를 위한 선택적 단계로 사용될 수 있습니다. 이 기법은 표적 단백질과 자성 나노입자에 접합된 포획 단백질 사이의 “lock-and-key" 일치로 인해 표적 단백질을 특이적으로 농축할 수 있습니다.
• 280nm에서 흡광도, 로리 분석법, 브래드포드 분석법 또는 비신코닌 분석법(BCA)을 통해 단백질 농도를 측정합니다.
• 추가 분석에 필요할 때까지 단백질 추출물을 -80°C 또는 -20°C에서 보관합니다.

침전 및 차등 가용화 (Precipitation and differential solubilization)

차등 단백질 침전은 단백질 정제의 신속하고 경제적인 단계이며 폴리펩타이드의 고유한 물리화학적 특성을 활용하는 것을 기반으로 합니다. 숙주 세포에서 용해된 재조합 단백질의 침전은 일반적으로 추가 정제 단계 전에 원하는 단백질을 농축하는 데 사용됩니다.

원심분리

이 공정은 원심력을 사용하여 액체에 부유하는 다양한 질량 또는 밀도의 입자 혼합물을 분리합니다. 단백질 또는 박테리아 세포와 같은 기타 입자상 물질이 혼합된 용기(일반적으로 튜브 또는 병)를 고속으로 회전시키면 각 운동량이 각 입자에 질량에 비례하는 외력을 생성합니다.

이 힘으로 인해 특정 입자가 액체를 통과하는 경향은 액체가 입자에 가하는 저항에 의해 상쇄됩니다. 원심분리기에서 샘플을 "회전"시키는 순 효과는 거대하고 작고 밀도가 높은 입자가 덜 거대하거나 액체에서 "항력"이 더 큰 입자보다 바깥쪽으로 더 빨리 이동한다는 것입니다.

크로마토그래피 기법

현재 크로마토그래피에 사용할 수 있는 다양한 차세대 흡착제와 멤브레인이 있습니다. 이러한 새로운 크로마토그래피 배지는 기존 제품에 비해 아래에 나열된 장점들로 성능이 크게 개선된 것이 특징입니다:

• 더 높은 동적 결합 용량
• 더 높은 작동 유량
• 특이하고 차별화된 보존 메커니즘

그럼에도 불구하고 기존 배지(아가로스 또는 폴리머 기반)는 FDA 또는 EMA 승인된 애플리케이션에서 단백질 정제에 대한 적합성이 입증되었기 때문에 계속해서 일상적으로 사용되고 있습니다.

실제 경험에 따르면 개별 공정 단계(포획, 정제, 정제)를 최적화하면 비용을 크게 절감할 수 있습니다. 그러나 주로 다운스트림 공정에 배치된 모든 흡착제 및 멤브레인 기반 단위 작업을 조합하여 효과적으로 공정 비용을 절감을 할 수도 있습니다.

단백질 정제의 6가지 크로마토그래피 기법

현재 단백질 시료를 정제하는 데 활용할 수 있는 크로마토그래피 기법은 여러 가지가 있는데 그 중 대표적인 기법들을 소개드리겠습니다:

1. 크기 배제 크로마토그래피: 크로마토그래피는 다공성 젤을 사용하여 용액 또는 변성 조건에서 단백질을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 원리는 작은 분자가 다공성 매트릭스에서 더 큰 부피를 통과해야 한다는 것입니다. 결과적으로, 특정 범위 크기의 단백질은 겔 컬럼의 다른 쪽 끝에서 수집되기 전에 다양한 양의 용출액(용매)이 필요합니다.
2. 이온 교환 크로마토그래피: 이온 교환 크로마토그래피는 이온 전하의 성질과 정도에 따라 화합물을 분리합니다.
    
3. 친화성 크로마토그래피: 친밀도 크로마토그래피는 분자 형태에 기반한 분리 기법으로, 주로 애플리케이션별 수지 제품을 달리하여 사용합니다. 이러한 수지는 표면에 분리할 화합물에 특정한 리간드가 부착되어 있습니다.
    
4. 금속 결합: 일반적인 기법은 단백질의 C-말단에 6~8개의 히스티딘 서열을 설계하는 것입니다. 폴리히스티딘은 니켈과 코발트 같은 2가 금속 이온에 강하게 결합합니다. 단백질은 고정된 니켈 이온이 포함된 컬럼을 통과하여 폴리히스티딘 태그와 결합할 수 있습니다. 태그가 없는 모든 단백질은 컬럼을 통과합니다.
    
5. 면역 친화성 크로마토그래피: 이 기법은 표적 단백질에 대한 항체의 특이적 결합을 사용하여 단백질을 선택적으로 정제합니다. 이 절차에는 항체를 컬럼 재료에 고정시킨 다음 다른 모든 물질은 통과시키면서 단백질만 선택적으로 결합시키는 과정이 포함됩니다.
    
6. HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피는 컬럼을 통해 용질을 더 빠르게 통과시키기 위해 고압을 가하는 크로마토그래피의 한 형태로 확산이 제한되고 해상도가 좋은 것이 장점입니다.

 

단백질 정제를 위한 친화성 태그

태그 단백질 정제란 무엇인가요?

• 태그 단백질 정제란 친밀도 크로마토그래피(AC)를 사용하여 특정 펩타이드 또는 단백질 서열(태그)을 포함하도록 조작된 재조합 단백질을 정제합니다.
• 단백질 친화성 태그에는 폴리히스티딘(히스티딘 태그), 글루타치온 S-전이효소(GST), 말토오스 결합 단백질(MBP), Strep-tag® II 및 FLAG™ 태그가 일반적으로 선택됩니다. His 태그가 부착된 단백질은 IMAC(고정 금속 친화성 크로마토그래피)라는 변형된 친화성 크로마토그래피로 정제됩니다.
• 태그는 정제를 간소화하고 과학자들이 표준 프로토콜을 사용할 수 있게 해줍니다. 관심 있는 단백질의 수율, 순도, 용해도를 개선하고 필요한 정제 단계의 수를 최소화합니다. 또한 검출을 위해 태그를 사용할 수도 있습니다.
• "친화성 태그"는 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단에 부착되는 고유한 단백질/펩타이드입니다. 이러한 태그는 단백질 정제에 도움이 됩니다. 또한 일부 친화성 태그는 까다로운 단백질 표적에 대한 용해도 향상제로서 이중 용도로도 사용됩니다.

 

단백질 복합체를 위한 풀다운 방법

정의
풀다운 분석은 두 개 이상의 단백질 간의 물리적 상호작용을 감지하는 데 사용되는 시험관 내 기법으로, 예측된 단백질과 단백질 간의 상호작용을 확인하거나 새로운 상호작용 파트너를 식별하는 데 매우 유용한 도구입니다.

목적
단백질 상호작용은 단백질과 세포가 다양한 조건에서 어떻게 기능하는지에 대해 많은 것을 밝혀줍니다. 풀다운 분석법을 사용하면 직접적인 단백질 상호작용을 살펴볼 수 있으며, 컬럼의 비드에 결합된 미끼 단백질을 활용하여 단백질 결합 파트너를 포착할 수 있습니다.

이 기법은 웨스턴 블롯을 통해 예측된 단백질 상호작용을 확인하거나 전체 단백질 염색을 사용하여 새로운 단백질 상호작용을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

풀다운 분석은 새로운 단백질 상호작용을 식별하거나 여러 질병에 대해 다양한 조건에서 단백질이 어떻게 결합하는지 평가하는 데 사용할 수 있으며, 단순히 세포 내부에서 일어나는 일을 더 잘 파악할 수 있는 정보를 제공할 수도 있습니다.

 

1. 친화도 풀다운 분석

정의
풀다운 분석은 단백질 복합체를 비드에 흡착하여 분리하는 방법입니다. 비드에 고정된 리간드는 특이성 태그(예: GST, 히스티딘, 말토오스 결합 단백질 등) 또는 항체를 통해 복합체의 구성 요소에 특이적으로 결합합니다

풀다운 분석은 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 매핑하는 데 중요한 도구입니다. 풀다운 분석은 여러 유기체(예: 효모, 대장균, C. elegans)에서 단백질과 단백질 간의 상호작용을 매핑하는 데 전 세계적으로 성공적으로 사용되어 왔습니다.

프로세스
실험에 적합한 대조군 설계가 필수적입니다.

단백질 복합체의 분리 및 후속 식별을 위해 특이성 풀다운 분석이 잘 확립되어 있습니다. GST 풀다운 분석은 GST 태그가 부착된 미끼 단백질을 사용하여 생물학적 샘플에서 하나 또는 여러 개의 알려지지 않은 단백질의 특이성 정제를 포함합니다.

기본 원리는 GST 태그 미끼 단백질이 파트너와 결합하고 그 결과 복합체가 고정된 글루타치온이 있는 비드에 포획된다는 것입니다. 미끼 단백질이 없을 때 GST에 결합하는 위양성을 식별하기 위한 대조군이 포함되어 있습니다.

대조군은 미끼 융합 단백질이 아닌 GST를 발현하는 개별적으로 형질 전환된 세포의 용해물 또는 GST가 첨가된 비형질 전환 세포의 용해물일 수 있습니다.

 

2. 탠덤 친화성 정제

정의
탠덤 친화성 정제(또는 "TAP 방법")는 수정 여부에 관계없이 효모, 트리파노솜, 과일 파리, 인간 및 식물에서 복합체를 정제하고 식별하는 데 사용되었습니다.

이 기법은 단백질 복합체를 분리하기 위해 두 가지 연속적인 친밀도 크로마토그래피 단계를 사용합니다. 두 개의 특이도 단계를 사용하는 이유는 정제 절차의 특이성을 향상시켜 오탐의 수를 줄이기 위해서입니다. 또한, 무결성을 보존하고 수율을 극대화하기 위해 이 기법 전체에 사용되는 조건은 까다롭지 않은 편이며 많은 사례에서 성공적으로 사용되었습니다.

프로세스
미끼 단백질(알려진 또는 의심되는 복합 성분)에 단백질 A와 칼모둘린 결합 펩타이드(CBP)를 모두 태그하고 두 태그 사이에 담배 에치 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위를 배치합니다.

이중 태그 미끼 단백질은 과발현이 비생리학적 상호작용을 유발할 수 있으므로 자연에 가까운 수준으로 발현됩니다. 이 복합체는 먼저 단백질 A 태그를 통해 IgG 세파로스 비드에 흡착된 후 TEV로 절단하여 용출됩니다.

 

3. 공동 면역 침전을 통한 단백질 상호작용 확인

정의
면역 침전은 항체를 사용하여 조잡한 생물학적 샘플에서 항원을 분리하는 잘 정립된 기법입니다.

이 이름은 역사적으로 유래되었으며 항체와 항원을 정확한 비율로 혼합할 때 얻어진 침전 반응을 기반으로 한 분석 방법에서 유래되었습니다.

개요
공동 면역 침전은 복합체의 한 가지(알려진 또는 추정되는) 구성 요소에 대한 항체를 사용합니다. 항체는 다중 단백질 복합체의 일부인 항원에 결합합니다. 그런 다음 혼합물에 단백질 A 또는 단백질 G 세파로스 비드를 추가하여 항체-단백질 복합체 어셈블리를 포획합니다.

 

단백질 정제의 다운스트림 최적화

재조합 단백질 및 기타 생물학적 제제의 다운스트림 최적화의 궁극적인 목표는 회수율을 개선하고 생산된 단백질 그램당 비용을 절감하는 것입니다.

이를 위해서는 동일한 양의 레진과 완충 물질로 더 많은 양의 의약품을 더 짧은 시간에 생산해야 합니다. 바이오 제조업체는 최신 세대의 혼합 모드 및 다중 모드 레진과 보다 효율적인 버퍼 관리 방식을 더 잘 활용함으로써 이를 달성할 수 있습니다.

Avantor의 서비스팀은 고객과 긴밀히 협력하여 바이오의약품 스케일업 병목 현상을 파악하고 생산 공정을 간소화하며 효율성과 생산성을 개선하여 생명을 구하는 솔루션의 출시 시간을 단축할 수 있도록 지원합니다.

다운스트림 공정 최적화에 대한 자세한 내용은 서비스 페이지를 참조하세요.

전반적인 임상부터 상업적 제조에 이르기까지 Avantor는 바이오 제약 고객과 긴밀히 협력하여 다운스트림 최적화 처리 시간을 단축함으로써 바이오 제약 고객이 새로운 치료제를 더 빨리 시장에 출시할 수 있도록 지원합니다.

이와 관련하여 도움이 필요하신 경우 Avantor의 전문가에게 문의하세요.